Изменения

[[Компьютерное зрение |Компьютерное зрение]] помогает автоматизировать обработку изображений, полученных с помощью микроскопии. С его появлением стало возможным эффективно и с хорошей точностью классифицировать клетки, сегментировать полученные изображения, улучшать их качество и решать другие задачи без участия человека<ref>[https://core.ac.uk/download/pdf/81981016.pdf Gaudenz Danuser {{---}} Computer Vision in Cell Biology, 2011]</ref>.

На данный момент компьютерное зрение нашло применение в большинстве направлений, где есть необходимость обрабатывать и анализировать изображения. Микроскопия не стала исключением. Теперь задачи, направленные непосредственно на работу с изображениями, можно решить используя методы [[Глубокое обучение|глубокого обучения]], например, построить подходящую [[Сверточные нейронные сети |сверточную нейронную сеть]]<ref>[https://www.researchgate.net/publication/221786123_Computer_Vision_for_Microscopy_Applications Nikita V Orlov {{---}} Computer Vision for Microscopy Applications, 2007]</ref>.

[[Файл:Dividing Cell Fluorescence-ru.jpg|left|300px|thumb|Рисунок 1. Пример клетки с различными флуоресцентными маркерами. <ref>[https://pubmed.ncbiru.nlmwikipedia.nih.govorg/wiki/30865716%D0%A4%D0%BB%D1%83%D0%BE%D1%80%D0%B5%D1%81%D1%86%D0%B5%D0%BD%D1%86%D0%B8%D1%8F_%D0%B2_%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D1%85_%D0%B8%D1%81%D1%81%D0%BB%D0%B5%D0%B4%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%8F%D1%85 Википедия: Флуоресценция в биологических исследованиях]</ статьиref>.]]]Классификация клеток является базовой задачей микроскопии. Обычно для этого используются изображения, полученные на флуоресцентных микроскопах(рисунок 1), так как классификаторы для изображений с обычных оптических микроскопов не способны отразить биологическое разнообразие различных типов клеток. Клетки можно делить по фазе в клеточном цикле, типу (повержденные или нет, раковые или нормальные), физиологическому состоянию, виду и другим признакам. Для большинства задач классификации уже существуют готовые архитектуры сверточных сетей<ref>[https://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:1334417/FULLTEXT01.pdf Håkan Öhrn {{---}} General image classifier for fluorescence microscopy using transfer learning , 2019]</ref><ref name="phase">[https://www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information Philipp Eulenberg {{---}} Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2017]</ref><ref name="cancer">[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ Ronald Wihal Oei {{---}} Convolutional neural network for cell classification using microscope images of intracellular actin networks, 2019]</ref><ref name="blood">[https://www.nature.com/articles/s41598-020-59215-9 Ahmed T. Sahlol {{---}} Efficient Classification of White Blood Cell Leukemia with Improved Swarm Optimization of Deep Features, 2020]</ref><ref>[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/817544v1.full Samuel Berryman {{---}} Image-based Cell Phenotyping Using Deep Learning, 2019]</ref><ref>[http://www.mva-org.jp/Proceedings/2017USB/papers/06-01.pdf Nan Meng {{---}} Computational single-cell classification using deep learning on bright-field and phase images, 2017]</ref><ref>[https://arxiv.org/pdf/1806.01313.pdf Sachin Mehta {{---}} Y-Net: Joint Segmentation and Classification for Diagnosis of Breast Biopsy Images, 2018]</ref>. 

Одним из признаков, по которым можно разделить клетки, является определение фазы клеточного цикла, в которой находится клетка. Эта задача имеет практическое применение для обнаружения поврежденных клеток, которые при визуализации будут кластеризоваться отдельно от остальных. Сверточная сеть для решения задачи изображена на рисунке 2. Она обучается на изображениях с флуоресцентными метками, о которых было сказано ранее, и дает на выходе не только классификацию каждой клетки, а также визуализирует процесс клеточного цикла, используя нелинейное уменьшение размерности<ref name="phase"/>. Классификация и визуализация являются всего лишь различными способами интерпретации результатов, поэтому строятся на основе одних и тех же выведенных закономерностей. [[Файл:Cell cycle classification.png|right|700px|thumb|Рисунок 2. Архитектура сверточной нейронной сети для определения фазы клетки из [https:<ref name="phase"//www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information/ статьи>.]]]Особенностью работы данной описанной сверточной сети является необходимость разметить только небольшую часть данных, на основании чего она далее учится размечать самостоятельно. Интересно, что при визуализации фазы становятся упорядочены в хронологически правильном порядке, несмотря на то, что информация о порядке фаз не передавалась в сеть напрямую. Это говорит об эффективности использования флуорисцентных флуоресцентных меток в качестве категориальных<ref>[https://www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information Philipp Eulenberg — Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2017]</ref>.

[[Файл:microscopy_cnn.png|right|400px|thumb|Рисунок 3. Архитектура сверточной нейронной сети для классификации раковых клеток из [https:/<ref name="cancer"/pubmed>.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ статьи.]]]Другой задачей классификации является обнаружение раковых клеток. Для ее решения используется сверточная нейронная сеть с архитектурой , изображенная на рисунке 3. Она имеет архитектуру VGG-16, в которой дополнительно после каждой функции активации добавлена [[Batch-normalization|пакетная нормализация]] для регуляризации<ref name="cancer"/>. Сеть, как и остальные классификаторы изображений микроскопии, принимает на вход изображения с флуоресцентными метками.

Особенностью при обучении сетки представленной сети является использование из-за недостаточного объема данных [[Глубокое обучение|трансферного обучения]], то есть модель предварительно обучается на другом огромном объеме данных. В данном случае первые 14 слоев сначала обучаются на наборе данных классификации ImageNet, а потом уже происходит обучение для классификации раковых и нормальных клеток. Такая сверточная сеть лучше справляется с задачей классификации клеток по сравнению с экспертом-человеком, особенно на изображениях с недостаточно хорошим качеством<ref>[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ Ronald Wihal Oei {{---}} Convolutional neural network for cell classification using microscope images of intracellular actin networks, 2019]</ref>.

[[Файл:Vggnet sessa.jpg|left|400px|thumb|Рисунок 4. Блок-схема подхода к классификации лейкоцитов<ref name="blood"/>.]]Эта задача отличается от предыдущих тем, что не требует предварительной обработки материалов и использования флуоресцентного микроскопа, для ее решения достаточно изображений с оптического микроскопа. Лейкоциты важно уметь классифицировать, потому что они играют значительную роль в организме человека и (иногда в крови могут образоваться злокачественные лейкоциты, которые способны вызывать лейкемию). Автоматическая классификация лейкоцитов может помочь специалистам в лабораториях слаборазвитых стран, где нет достаточного количества квалифицированных сотрудников для проведения анализа крови.

Для решения задачи используется сеть VGGNet, похожая на ту, что идентифицирует раковые клетки, и так же транзитное [[Глубокое обучение|трансферное обучение]]. Отличительной деталью является использования статистического для оптимизации статистически усиленного алгоритма оптимизации под названием сальпового роя (англ. Statistically Enhanced Salp Swarm Algorithm, SESSA )<ref name="blood"/> для выбора наиболее важных функций, извлеченных с помощью сети VGGNet, и удаления сильно коррелированных и шумныхфункций. Общая структура алгоритма представлена на рисунке 4. Такая оптимизация позволяет сократить время обучения, повысить точность и избавиться от переобучения. Результаты этого гибридного подхода к классификации являются самыми эффективными среди всех известных опубликованных работ по тому же набору данных.

Задача [[Сегментация изображений|сегментации изображений]], полученных с микроскопа, состоит в том, чтобы аннотировать их, то есть отмечать границы объектов (клеток, ядер). Имея сегментированное изображение, легче проводить дальнейший анализ и изучать конкретные части клетки<ref>[https://www.nature.com/articles/s41524-020-00363-x James P. Horwath {{---}} Understanding important features of deep learning models for segmentation of high-resolution transmission electron microscopy images, 2020]</ref>.[[Файл:DRAN.jpeg|250px|left|thumb|Рисунок 5. Архитектура сети DRAN для сегментации ядер<ref name="dran">[https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2019.00053/full Quoc Dang Vu {{---}} Methods for Segmentation and Classification of Digital Microscopy Tissue Images, 2019]</ref>.]] 

Для решения задачи сегментации обычно используется модифицированная полносвязная сверточная сеть U-Net<ref>[https://lmb.informatik.uni-freiburg.de/people/ronneber/u-net/ Olaf Ronneberger— Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2015]</ref>. Сеть U-Net получила широкое распространение благодаря способности последовательно распознавать как большие, так и мелкие частицы, а также устойчивости к различным условиям визуализации и наборам данных. Также она показывает хорошие результаты , даже если размер набора даных для обучения небольшой, что является частой проблемой анализа изображений, полученных с микроскопа. Однако минусом сети U-Net является ограничение на размер входного изображения, в то время как разрешение микроскопических изображений только растет с течением времени.

Сеть U-Net хоть и является универсальной, но для решения некоторых задач удобнее использовать более специализированные сети. Для задачи точной сегментации ядер клеток строится сеть глубокой остаточной агрегации (англ. Deep Residual Aggregation Network, DRAN)<ref name="dran"/>. Она имеет типичную для сегментирующих сетей архитектуру , представленную на рисунке 5, и состоит из нескольких слоев, понижающих степень дискретизации данных, затем нескольких расширяющих слоев с тремя декодерами.

Особенностью данных микроскопии является разный масштаб ядер на изображениях, поэтому в сеть подаются не только исходные изображения, а еще и уменьшенные и увеличенные в 2 раза. Такой подход частично решает проблему влияния существенно различающегося масштаба и получил название многомасштабной сети глубокой остаточной агрегации (англ. Multiscale Deep Residual Aggregation Network, MDRAN)<ref name="dran"/>.

== Улучшение качества Детекция клеток ==Во многих биологических экспериментах необходимо уметь детектировать клетки, за которыми ведется наблюдение, понимать сколько их, как они расположены относительно друг друга. Для решения этих задач в компьютерном зрении используется несколько разных подходов<ref>[https://ieeexplore.ieee.org/document/5711528 Takeo Kanade {{---}} Cell image analysis: Algorithms, system and applications, 2011]</ref>. Одни используют сверточные сети, чтобы предсказывать карту плотности, другие основаны на построении деревьев максимально устойчивых экстремальных областей. Вне зависимости от реализации, методы детекции клеток направлены на оценку количества клеток и учитывают перекрывания, неравномерность распредления клеток и другие факторы, специфичные для микроскопических изображений . === Подсчет клеток на основе сверточных сетей ===[[Файл:Autofocus cnnFCRN-A_and_FCRN_B.png|right425px|450pxthumb|thumbright|(a) Архитектура сверточной нейронной сети Рисунок 6. Архитекутры полносверточных регрессионных сетей для предсказывания положения фокуса микроскопа из построения карт плотности<ref name="fcrn">[https://www.naturerobots.comox.ac.uk/~vgg/publications/2016/articlesXie16/s41598xie16.pdf Weidi Xie {{-018-25458-w}} Microscopy cell counting and detection with fully convolutional regression networks, 2016]</ статьиref>.]]К автоматическому подсчету клеток можно подойти с разных сторон. Первый подход основан на детекции с предварительной сегментацией изображения. Процесс сегментации сам по себе сложен и существует более эффективный способ. В его основе лежит регрессия и оценка плотности без непосредственной детекции и сегментации. По карте плотности можно с хорошей точностью оценить количество клеток.  Особенностью изображений микроскопии является то, что клетки в большинстве случаев имеют размер значительно меньший, чем размер изображения, то есть нет необходимости использовать сложные глубокие сети, которые способны выучить высоко семантическую информацию. Поэтому используются полносверточные регрессионные сети (англ. Fully Convolutional Regression Networks, FCRN)<ref name="fcrn"/>. Различия в архитектурах состоят в размерах ядер и количестве слоев (рисунок 6). Такие сети на выходе дают карту плотности клеток.

(b) Примеры изображений Такой подход позволяет проводить непрерывное обучение с разным фокусным расстоянием.]]Зачастую изображения, полученные с помощью микроскопииизображениями произвольных размеров, не имеют достаточно хорошее что важно в том числе для дальнейшей работы качествопокадровой съемки и изучения длительных процесоов. Сверточные сети, которые улучшают качество уже имеющихся снимковОн также обеспечивает интуитивное понимание представлений функций из FCRN, не имеют отличийвизуализируя, связанных со специфичностью изображенийв какой степени информация была закодирована на разных уровнях.

Гораздо более интересная задача компьютерного зрения состоит в том=== Распознавание перекрывающихся объектов на основе деревьев экстремальных областей ===[[Файл:Extremal Region Trees.png|left|250px|thumb|Рисунок 7. Получающаяся древовидная структура<ref name="tree">[http://sites.skoltech.ru/app/data/uploads/sites/25/2014/11/MIA15.pdf Carlos Arteta {{---}} Detecting Overlapping Instances in Microscopy Images Using Extremal Region Trees, чтобы сразу получать более четкие изображения2016]</ref>. При покадровой съемке длительного непрерывного процесса необходимо постоянно следить за положением фокуса микроскопа]]Клетки на изображениях микроскопии могут быть распределены неравномерно, чтобы не получать размытые изображения. Процесс выставления фокуса можно автоматизироватьгруппироваться, перекрываться, построив сетьчто затрудняет подсчет количества клеток и их дальнейшее изучение, которая будет предсказывать нужное положение. Эту задачу можно свести так как стандартные методы применимы либо к задаче классификации изображений по фокусному расстоянию во время съемки. Для ее решения используется сверточная сетьизображениям с высокой плотностью объектов и не пытаются их разделить, которая состоит из двух блоков свертки и двух полносвязных блоков для классификациилибо наоборот эффективно работают только с изображениями с низкой плотностью.

Такая сверточная сеть показывает большую точностьЧтобы учесть все особенности изображения используется метод, чем группа людей-экспертовоснованный на древовидной дискретной графической модели, которая позволяет выбрать и промаркировать набор непересекающихся участков изображения с помощью глобальной оптимизации<ref name="tree"/>. По сравнению Каждый регион маркируется в соответствии с другими подходами к автофокусировкеколичеством объектов, сеть не требует физической калибровки которые он содержит. В условиях низкой плотности объектов метод, как правило, находит и устойчива к шумувыделяет отдельные клетки, а в местах, оптическим артефактам и особенностямгде клетки перекрываются, отличным от ячеек<ref>[https://wwwпредложенный метод выделяет группы клеток (рисунок 7).nature.com/articles/s41598-018-25458-w/ Ling Wei— Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning Подобное адаптивное поведение, управляемое оптимизационным процессом, 2018]</ref>является уникальным для данного метода.

== Детекция клеток ==Во многих биологических экспериментах необходимо уметь детектировать клеткиНужно также отметить, что вывод модели эффективен с точки зрения вычислений и требует всего нескольких сотен оценок классификатора, за которыми ведется наблюдение, понимать сколько их, как они расположены относительно друг друга. Для решения этих задач в компьютерном зрении используется несколько разных подходов. Одни используют сверточные сети, чтобы предсказывать карту плотности, другие основаны на построении деревьев максимально устойчивых экстремальных областей. Вне зависимости от реализации, методы детекции клеток направлены следует динамическое программирование на оценку количетсва клеток и учитывают перекрывания, неравномерность распредления клеток и другие факторы, специфичные для микроскопических изображенийподдеревьях.

==Склеивание изображений = Подсчет клеток =Не всегда изучаемый объект полностью помещается на один снимок микроскопа. В связи с этим стоит задача склеивания изображений для дальнейшего исследования целых клеточных культур, используя различные методы визуализации. Эту задачу может решить инструмент для сшивания изображений микроскопии (англ. Microscopy Image Stitching Tool, MIST)<ref>[https://ieeexplore.ieee.org/document/7359951 Joe Chalfoun {{---}} MIST: Microscopy Image Stitching Tool, 2015]</ref>. Программа предназначена для быстрого и точного склеивания больших двумерных сеток перекрывающихся изображений покадровых снимков микроскопа. В основе работы MIST лежит оценка параметров модели на основе сверточных сетей ===вычисленных попарных перемещений, а затем минимизация ошибок склеивания путем оптимизации перемещений в пределах квадратной области. [[Файл:FCRN-A_and_FCRN_BMIST.pngjpg|left|425px450px|thumb|right|Архитекутры сетей FCRNРисунок 8. Примеры изображений, склеенных с помощью MIST<ref name="mist">[https://www.nature.com/articles/s41598-017-04567-y Joe Chalfoun {{--A и FCRN-B для построения карт плотности}} MIST: Accurate and Scalable Microscopy Image Stitching Tool with Stage Modeling and Error Minimization, 2017]</ref>.]]К автоматическому подсчету клеток можно подойти с разных сторонАлгоритм MIST состоит из четырех шагов<ref name="mist"/>. Сначала вычисляются всевозможные перемещения между соседними покадровыми изображениями. Первый подход основан После чего, если параметры модели не указаны пользователем, оценивается модель механического предметного столика на детекции с предварительной сегментацией изображенияоснове вычисленных перемещений. Процесс сегментации сам по себе сложен и существует более эффективный способ. В его основе лежит регрессия Затем оптимизируются перемещения между изображениями для уменьшения ошибок склеивания и оценка плотности без непосредственной детекции и сегментации. По карте плотности можно с хорошей точностью оценить количество клеток. Рассмотрим, как она строитсясоставляется полученное изображение (рисунок 8).

Особенностью изображений микроскопии является тоНеобходимо помнить, что клетки в большинстве случаев имеют размер значительно меньшийMIST был разработан для склеивания микроскопических изображений, чем размер изображенияполученных с помощью механического предметного столика, то есть нет необходимости использовать сложные глубокие сетикоторый перемещает образец по повторяющейся сетке, которые способны выучить высоко семантическую информацию. Поэтому используются сети с архитектурой FCRN-A или FCRN-B. Различия в архитектурах состоят в размерах ядер и количестве слоев. Такие сети что накладывает ограничение на выходе дают карту плотности клетокего использование.

Такой подход позволяет проводить непрерывное обучение == Улучшение качества изображений ==[[Файл:Autofocus cnn.png|leftright|400px|thumb|Рисунок 9. (a) Архитектура сверточной нейронной сети для предсказания положения фокуса микроскопа.(b) Примеры изображений с разным фокусным расстоянием<ref name="focus">[https://www.nature.com/articles/s41598-018-25458-w/ Ling Wei {{---}} Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2018]</ref>.]]Зачастую изображения, полученные с изображениями произвольных размеровпомощью микроскопии, что важно в том числе не имеют достаточно хорошее для покадровой съемке и изучением длительных процесоовдальнейшей работы качество. Он также обеспечивает интуитивное понимание представлений функций из FCRNЕсть разные способы борьбы с этим. Можно улучшать качество двумерных изображений стандартными методами, не имеющих отличий, связанных со специфичностью данных, визуализируяили же заранее пытаться получить высококачественное изображение, в какой степени информация была закодирована на разных уровняхпредсказывая положение фокуса.

=== Обнаружение перекрывающихся объектов на основе деревьев экстремальных областей Предсказание положения фокуса ===[[Файл:Extremal Region TreesПри покадровой съемке длительного непрерывного процесса необходимо постоянно следить за положением фокуса микроскопа, чтобы не получать размытые изображения.png|left|250px|thumb|Получающаяся древовидная структура из [http://sitesПроцесс выставления фокуса можно автоматизировать, построив сеть, которая будет предсказывать нужное положение.skoltech.ru/app/data/uploads/sites/25/2014/11/MIA15Эту задачу можно свести к задаче классификации изображений по фокусному расстоянию во время съемки.pdf статьи]]]Клетки на изображениях микроскопии могут быть распределены неравномерноДля ее решения используется сверточная сеть (рисунок 9), группироваться, перекрываться, что затрудняет подсчет количества клеток которая состоит из двух блоков свертки и их дальнейшее изучение, так как стандартные методы применимы либо к изображениям с высокой плотностью объектов и не пытаются их разделить, либо наоборот эффективно работают только с изображениями с низкой плотностьюдвух полносвязных блоков для классификации<ref name="focus"/>.

Чтобы учесть все особенности изображения используется методТакая сверточная сеть показывает большую точность, основанный на древовидной дискретной графической модели, которая позволяет выбрать и промаркировать набор непересекающихся участков изображения с помощью глобальной оптимизациичем группа людей-экспертов. Каждый регион маркируется в соответствии По сравнению с количеством объектовдругими подходами к автофокусировке, которые он содержит. В условиях низкой плотности объектов метод, как правилосеть не требует физической калибровки и устойчива к шуму, находит оптическим артефактам и выделяет отдельные клетки, а в местах, где клетки перекрываются, предложенный метод выделяет группы клеток. Подобное адаптивное поведение, управляемое оптимизационным процессом, является уникальным для данного методадругим особенностям.

Нужно также отметить=== Восстановление рассеянных трехмерных изображений ===[[Файл:3d restoration net.jpeg|right|400px|thumb|Рисунок 10. Схема работы архитектуры ScatNet<ref name="scatnet">[https://www.osapublishing.org/oe/fulltext.cfm?uri=oe-28-20-30234&id=439993 Le Xiao {{---}} Deep learning-enabled efficient image restoration for 3D microscopy of turbid biological specimens, что вывод модели эффективен с точки зрения вычислений 2020]</ref>.]]Трехмерная флуоресцентная микроскопия является важным инструментом для современных исследований, но ее более широкому применению препятствует рассеяние света биологическими образцами. В основе подхода, который способен восстановить размытое и требует всего нескольких сотен оценок классификаторарассеянное светом трехмерное изображение глубоких тканей, за которыми следует динамическое программирование на поддеревьяхлежит сеть ScatNet<ref>[https://www.di.ens.fr/data/software/scatnet/ ScatNet: homepage of the project]</ref>.

== Склеивание Такой подход позволяет с помощью вычислений увеличить глубину визуализации изображений ==трехмерной флуоресцентной микроскопии без добавления сложной оптики или моделей оптического рассеяния, так как основан только на мощных возможностях прогнозирования сверточной нейронной сети.

#* [[ Компьютерное зрение ]]#* [[ Глубокое обучение ]]* [[ Сверточные нейронные сети ]]#* [[ Batch-normalization ]]* [[ Сегментация изображений ]]