Изменения

[[Компьютерное зрение |Компьютерное зрение]] помогает автоматизировать обработку изображений, полученных с помощью микроскопии. С его появлением стало возможным эффективно и с хорошей точностью классифицировать клетки, сегментировать полученные изображения, улучшать их качество и решать другие задачи без участия человека<ref>[https://core.ac.uk/download/pdf/81981016.pdf Gaudenz Danuser {{---}} Computer Vision in Cell Biology, 2011]</ref>.

На данный момент компьютерное зрение нашло применение в большинстве направлений, где есть необходимость обрабатывать и анализировать изображения. Микроскопия не стала исключением. Теперь задачи, направленные непосредственно на работу с изображениями, можно решить используя методы [[Глубокое обучение|глубокого обучения]], например, построить подходящую [[Сверточные нейронные сети |сверточную нейронную сеть]]<ref>[https://www.researchgate.net/publication/221786123_Computer_Vision_for_Microscopy_Applications Nikita V Orlov {{---}} Computer Vision for Microscopy Applications, 2007]</ref>.

[[Файл:Dividing Cell Fluorescence-ru.jpg|left|300px|thumb|Рисунок 1. Пример клетки с различными флуоресцентными маркерами. <ref>[https://pubmed.ncbiru.nlmwikipedia.nih.govorg/wiki/30865716%D0%A4%D0%BB%D1%83%D0%BE%D1%80%D0%B5%D1%81%D1%86%D0%B5%D0%BD%D1%86%D0%B8%D1%8F_%D0%B2_%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D1%85_%D0%B8%D1%81%D1%81%D0%BB%D0%B5%D0%B4%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%8F%D1%85 Википедия: Флуоресценция в биологических исследованиях]</ статьиref>.]]]Классификация клеток является базовой задачей микроскопии. Обычно для этого используются изображения, полученные на флуоресцентных микроскопах(рисунок 1), так как классификаторы для изображений с обычных оптических микроскопов не способны отразить биологическое разнообразие различных типов клеток. Клетки можно делить по фазе в клеточном цикле, типу (повержденные или нет, раковые или нормальные), физиологическому состоянию, виду и другим признакам. Для большинства задач классификации уже существуют готовые архитектуры сверточных сетей<ref>[https://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:1334417/FULLTEXT01.pdf Håkan Öhrn {{---}} General image classifier for fluorescence microscopy using transfer learning , 2019]</ref><ref name="phase">[https://www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information Philipp Eulenberg {{---}} Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2017]</ref><ref name="cancer">[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ Ronald Wihal Oei {{---}} Convolutional neural network for cell classification using microscope images of intracellular actin networks, 2019]</ref><ref name="blood">[https://www.nature.com/articles/s41598-020-59215-9 Ahmed T. Sahlol {{---}} Efficient Classification of White Blood Cell Leukemia with Improved Swarm Optimization of Deep Features, 2020]</ref><ref>[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/817544v1.full Samuel Berryman {{---}} Image-based Cell Phenotyping Using Deep Learning, 2019]</ref><ref>[http://www.mva-org.jp/Proceedings/2017USB/papers/06-01.pdf Nan Meng {{---}} Computational single-cell classification using deep learning on bright-field and phase images, 2017]</ref><ref>[https://arxiv.org/pdf/1806.01313.pdf Sachin Mehta {{---}} Y-Net: Joint Segmentation and Classification for Diagnosis of Breast Biopsy Images, 2018]</ref>. 

Одним из признаков, по которым можно разделить клетки, является определение фазы клеточного цикла, в которой находится клетка. Эта задача имеет практическое применение для обнаружения поврежденных клеток, которые при визуализации будут кластеризоваться отдельно от остальных. Сверточная сеть для решения задачи изображена на рисунке 2. Она обучается на изображениях с флуоресцентными метками, о которых было сказано ранее, и дает на выходе не только классификацию каждой клетки, а также визуализирует процесс клеточного цикла, используя нелинейное уменьшение размерности<ref name="phase"/>. Классификация и визуализация являются всего лишь различными способами интерпретации результатов, поэтому строятся на основе одних и тех же выведенных закономерностей. [[Файл:Cell cycle classification.png|right|700px|thumb|Рисунок 2. Архитектура сверточной нейронной сети для определения фазы клетки из [https:<ref name="phase"//www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information/ статьи>.]]]Особенностью работы данной описанной сверточной сети является необходимость разметить только небольшую часть данных, на основании чего она далее учится размечать самостоятельно. Интересно, что при визуализации фазы становятся упорядочены в хронологически правильном порядке, несмотря на то, что информация о порядке фаз не передавалась в сеть напрямую. Это говорит об эффективности использования флуорисцентных флуоресцентных меток в качестве категориальных<ref>[https://www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information Philipp Eulenberg — Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2017]</ref>.

[[Файл:microscopy_cnn.png|right|400px|thumb|Рисунок 3. Архитектура сверточной нейронной сети для классификации раковых клеток из [https:/<ref name="cancer"/pubmed>.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ статьи.]]]Другой задачей классификации является обнаружение раковых клеток. Для ее решения используется сверточная нейронная сеть с архитектурой , изображенная на рисунке 3. Она имеет архитектуру VGG-16, в которой дополнительно после каждой функции активации добавлена [[Batch-normalization|пакетная нормализация]] для регуляризации<ref name="cancer"/>. Сеть, как и остальные классификаторы изображений микроскопии, принимает на вход изображения с флуоресцентными метками.

Особенностью при обучении сетки представленной сети является использование из-за недостаточного объема данных [[Глубокое обучение|трансферного обучения]], то есть модель предварительно обучается на другом огромном объеме данных. В данном случае первые 14 слоев сначала обучаются на наборе данных классификации ImageNet, а потом уже происходит обучение для классификации раковых и нормальных клеток. Такая сверточная сеть лучше справляется с задачей классификации клеток по сравнению с экспертом-человеком, особенно на изображениях с недостаточно хорошим качеством<ref>[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ Ronald Wihal Oei {{---}} Convolutional neural network for cell classification using microscope images of intracellular actin networks, 2019]</ref>.

[[Файл:Vggnet sessa.jpg|left|400px|thumb|Рисунок 4. Блок-схема подхода к классификации лейкоцитов<ref name="blood"/>.]]Эта задача отличается от предыдущих тем, что не требует предварительной обработки материалов и использования флуоресцентного микроскопа, для ее решения достаточно изображений с оптического микроскопа. Лейкоциты важно уметь классифицировать, потому что они играют значительную роль в организме человека и (иногда в крови могут образоваться злокачественные лейкоциты, которые способны вызывать лейкемию). Автоматическая классификация лейкоцитов может помочь специалистам в лабораториях слаборазвитых стран, где нет достаточного количества квалифицированных сотрудников для проведения анализа крови.

Для решения задачи используется сеть VGGNet, похожая на ту, что идентифицирует раковые клетки, и так же транзитное [[Глубокое обучение|трансферное обучение]]. Отличительной деталью является использования статистического для оптимизации статистически усиленного алгоритма оптимизации под названием сальпового роя (англ. Statistically Enhanced Salp Swarm Algorithm, SESSA )<ref name="blood"/> для выбора наиболее важных функций, извлеченных с помощью сети VGGNet, и удаления сильно коррелированных и шумныхфункций. Общая структура алгоритма представлена на рисунке 4. Такая оптимизация позволяет сократить время обучения, повысить точность и избавиться от переобучения. Результаты этого гибридного подхода к классификации являются самыми эффективными среди всех известных опубликованных работ по тому же набору данных.

Задача [[Сегментация изображений|сегментации изображений]], полученных с микроскопа, состоит в том, чтобы аннотировать их, то есть отмечать границы объектов (клеток, ядер). Имея сегментированное изображение, легче проводить дальнейший анализ и изучать конкретные части клетки<ref>[https://www.nature.com/articles/s41524-020-00363-x James P. Horwath {{---}} Understanding important features of deep learning models for segmentation of high-resolution transmission electron microscopy images, 2020]</ref>.[[Файл:DRAN.jpeg|250px|left|thumb|Рисунок 5. Архитектура сети DRAN для сегментации ядер<ref name="dran">[https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2019.00053/full Quoc Dang Vu {{---}} Methods for Segmentation and Classification of Digital Microscopy Tissue Images, 2019]</ref>.]] 

Для решения задачи сегментации обычно используется модифицированная полносвязная сверточная сеть U-Net<ref>[https://lmb.informatik.uni-freiburg.de/people/ronneber/u-net/ Olaf Ronneberger— Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2015]</ref>. Сеть U-Net получила широкое распространение благодаря способности последовательно распознавать как большие, так и мелкие частицы, а также устойчивости к различным условиям визуализации и наборам данных. Также она показывает хорошие результаты , даже если размер набора даных для обучения небольшой, что является частой проблемой анализа изображений, полученных с микроскопа. Однако минусом сети U-Net является ограничение на размер входного изображения, в то время как разрешение микроскопических изображений только растет с течением времени.

Сеть U-Net хоть и является универсальной, но для решения некоторых задач удобнее использовать более специализированные сети. Для задачи точной сегментации ядер клеток строится сеть глубокой остаточной агрегации (англ. Deep Residual Aggregation Network, DRAN)<ref name="dran"/>. Она имеет типичную для сегментирующих сетей архитектуру , представленную на рисунке 5, и состоит из нескольких слоев, понижающих степень дискретизации данных, затем нескольких расширяющих слоев с тремя декодерами.

Особенностью данных микроскопии является разный масштаб ядер на изображениях, поэтому в сеть подаются не только исходные изображения, а еще и уменьшенные и увеличенные в 2 раза. Такой подход частично решает проблему влияния существенно различающегося масштаба и получил название многомасштабной сети глубокой остаточной агрегации (англ. Multiscale Deep Residual Aggregation Network, MDRAN)<ref name="dran"/>.

== Улучшение качества изображений Детекция клеток ==[[Файл:Autofocus cnnВо многих биологических экспериментах необходимо уметь детектировать клетки, за которыми ведется наблюдение, понимать сколько их, как они расположены относительно друг друга.png|right|450px|thumb|(a) Архитектура сверточной нейронной сети для предсказывания положения фокуса микроскопа из Для решения этих задач в компьютерном зрении используется несколько разных подходов<ref>[https://wwwieeexplore.natureieee.comorg/articlesdocument/s415985711528 Takeo Kanade {{-018-25458-w}} Cell image analysis: Algorithms, system and applications, 2011]</ статьи]ref>. Одни используют сверточные сети, чтобы предсказывать карту плотности, другие основаны на построении деревьев максимально устойчивых экстремальных областей. Вне зависимости от реализации, методы детекции клеток направлены на оценку количества клеток и учитывают перекрывания, неравномерность распредления клеток и другие факторы, специфичные для микроскопических изображений.

(b) Примеры изображений с разным фокусным расстоянием=== Подсчет клеток на основе сверточных сетей ===[[Файл:FCRN-A_and_FCRN_B.png|425px|thumb|right|Рисунок 6. Архитекутры полносверточных регрессионных сетей для построения карт плотности<ref name="fcrn">[https://www.robots.ox.ac.uk/~vgg/publications/2016/Xie16/xie16.pdf Weidi Xie {{---}} Microscopy cell counting and detection with fully convolutional regression networks, 2016]</ref>.]]Зачастую К автоматическому подсчету клеток можно подойти с разных сторон. Первый подход основан на детекции с предварительной сегментацией изображения, полученные . Процесс сегментации сам по себе сложен и существует более эффективный способ. В его основе лежит регрессия и оценка плотности без непосредственной детекции и сегментации. По карте плотности можно с помощью микроскопии, не имеют достаточно хорошее для дальнейшей работы качество. Сверточные сети, которые улучшают качество уже имеющихся снимков, не имеют отличий, связанных со специфичностью изображенийхорошей точностью оценить количество клеток.

Гораздо более интересная задача компьютерного зрения состоит Особенностью изображений микроскопии является то, что клетки в том, чтобы сразу получать более четкие изображения. При покадровой съемке длительного непрерывного процесса необходимо постоянно следить за положением фокуса микроскопабольшинстве случаев имеют размер значительно меньший, чтобы не получать размытые чем размер изображения. Процесс выставления фокуса можно автоматизировать, построив сетьто есть нет необходимости использовать сложные глубокие сети, которая будет предсказывать нужное положениекоторые способны выучить высоко семантическую информацию. Эту задачу можно свести к задаче классификации изображений по фокусному расстоянию во время съемкиПоэтому используются полносверточные регрессионные сети (англ. Для ее решения используется сверточная сетьFully Convolutional Regression Networks, которая состоит из двух блоков свертки FCRN)<ref name="fcrn"/>. Различия в архитектурах состоят в размерах ядер и двух полносвязных блоков для классификацииколичестве слоев (рисунок 6). Такие сети на выходе дают карту плотности клеток.

Такая сверточная сеть показывает большую точность, чем группа людей-экспертов. По сравнению Такой подход позволяет проводить непрерывное обучение с другими подходами к автофокусировкеизображениями произвольных размеров, сеть не требует физической калибровки что важно в том числе для покадровой съемки и устойчива к шумуизучения длительных процесоов. Он также обеспечивает интуитивное понимание представлений функций из FCRN, оптическим артефактам и особенностям, отличным от ячеек<ref>[https://www.nature.com/articles/s41598-018-25458-w/ Ling Wei— Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learningвизуализируя, 2018]</ref>в какой степени информация была закодирована на разных уровнях.

== Детекция клеток = Распознавание перекрывающихся объектов на основе деревьев экстремальных областей ===Во многих биологических экспериментах необходимо уметь детектировать клетки, за которыми ведется наблюдение, понимать сколько их[[Файл:Extremal Region Trees.png|left|250px|thumb|Рисунок 7. Получающаяся древовидная структура<ref name="tree">[http://sites.skoltech.ru/app/data/uploads/sites/25/2014/11/MIA15.pdf Carlos Arteta {{---}} Detecting Overlapping Instances in Microscopy Images Using Extremal Region Trees, как они расположены относительно друг друга2016]</ref>. Для решения этих задач в компьютерном зрении используется несколько разных подходов. Одни используют сверточные сети]]Клетки на изображениях микроскопии могут быть распределены неравномерно, чтобы предсказывать карту плотностигруппироваться, другие основаны на построении деревьев максимально устойчивых экстремальных областей. Вне зависимости от реализацииперекрываться, методы детекции клеток направлены на оценку количетсва что затрудняет подсчет количества клеток и учитывают перекрыванияих дальнейшее изучение, неравномерность распредления клеток так как стандартные методы применимы либо к изображениям с высокой плотностью объектов и другие факторыне пытаются их разделить, специфичные для микроскопических изображенийлибо наоборот эффективно работают только с изображениями с низкой плотностью.

=== Подсчет клеток Чтобы учесть все особенности изображения используется метод, основанный на основе сверточных сетей ===[[Файл:FCRN-A_and_FCRN_B.png|425px|thumb|right|Архитекутры сетей FCRN-A древовидной дискретной графической модели, которая позволяет выбрать и FCRN-B для построения карт плотности.]]К автоматическому подсчету клеток можно подойти промаркировать набор непересекающихся участков изображения с разных сторонпомощью глобальной оптимизации<ref name="tree"/>. Первый подход основан на детекции Каждый регион маркируется в соответствии с предварительной сегментацией изображения. Процесс сегментации сам по себе сложен и существует более эффективный способколичеством объектов, которые он содержит. В его основе лежит регрессия и оценка условиях низкой плотности без непосредственной детекции объектов метод, как правило, находит и сегментации. По карте плотности можно с хорошей точностью оценить количество выделяет отдельные клетки, а в местах, где клетки перекрываются, предложенный метод выделяет группы клеток(рисунок 7). Рассмотрим Подобное адаптивное поведение, управляемое оптимизационным процессом, как она строитсяявляется уникальным для данного метода.

Особенностью изображений микроскопии является тоНужно также отметить, что клетки в большинстве случаев имеют размер значительно меньший, чем размер изображения, то есть нет необходимости использовать сложные глубокие сети, которые способны выучить высоко семантическую информацию. Поэтому используются сети вывод модели эффективен с архитектурой FCRN-A или FCRN-B. Различия в архитектурах состоят в размерах ядер точки зрения вычислений и количестве слоев. Такие сети требует всего нескольких сотен оценок классификатора, за которыми следует динамическое программирование на выходе дают карту плотности клетокподдеревьях.

Такой подход позволяет проводить непрерывное обучение == Склеивание изображений ==Не всегда изучаемый объект полностью помещается на один снимок микроскопа. В связи с изображениями произвольных размеровэтим стоит задача склеивания изображений для дальнейшего исследования целых клеточных культур, используя различные методы визуализации. Эту задачу может решить инструмент для сшивания изображений микроскопии (англ. Microscopy Image Stitching Tool, MIST)<ref>[https://ieeexplore.ieee.org/document/7359951 Joe Chalfoun {{---}} MIST: Microscopy Image Stitching Tool, что важно в том числе 2015]</ref>. Программа предназначена для покадровой съемке быстрого и изучением длительных процесоовточного склеивания больших двумерных сеток перекрывающихся изображений покадровых снимков микроскопа. В основе работы MIST лежит оценка параметров модели на основе вычисленных попарных перемещений, а затем минимизация ошибок склеивания путем оптимизации перемещений в пределах квадратной области. Он также обеспечивает интуитивное понимание представлений функций [[Файл:MIST.jpg|left|450px|thumb|Рисунок 8. Примеры изображений, склеенных с помощью MIST<ref name="mist">[https://www.nature.com/articles/s41598-017-04567-y Joe Chalfoun {{---}} MIST: Accurate and Scalable Microscopy Image Stitching Tool with Stage Modeling and Error Minimization, 2017]</ref>.]]Алгоритм MIST состоит из FCRNчетырех шагов<ref name="mist"/>. Сначала вычисляются всевозможные перемещения между соседними покадровыми изображениями. После чего, визуализируяесли параметры модели не указаны пользователем, в какой степени информация была закодирована оценивается модель механического предметного столика на разных уровняхоснове вычисленных перемещений. Затем оптимизируются перемещения между изображениями для уменьшения ошибок склеивания и составляется полученное изображение (рисунок 8).

=== Обнаружение перекрывающихся объектов на основе деревьев экстремальных областей ===[[Файл:Extremal Region Trees.png|left|250px|thumb|Получающаяся древовидная структура из [http://sites.skoltech.ru/app/data/uploads/sites/25/2014/11/MIA15.pdf статьи]]]Клетки на изображениях микроскопии могут быть распределены неравномерно, группироваться, перекрыватьсяНеобходимо помнить, что затрудняет подсчет количества клеток и их дальнейшее изучениеMIST был разработан для склеивания микроскопических изображений, так как стандартные методы применимы либо к изображениям полученных с высокой плотностью объектов и не пытаются их разделитьпомощью механического предметного столика, либо наоборот эффективно работают только с изображениями с низкой плотностьюкоторый перемещает образец по повторяющейся сетке, что накладывает ограничение на его использование.

Чтобы учесть все особенности == Улучшение качества изображений ==[[Файл:Autofocus cnn.png|leftright|400px|thumb|Рисунок 9. (a) Архитектура сверточной нейронной сети для предсказания положения фокуса микроскопа.(b) Примеры изображений с разным фокусным расстоянием<ref name="focus">[https://www.nature.com/articles/s41598-018-25458-w/ Ling Wei {{---}} Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2018]</ref>.]]Зачастую изображения используется метод, основанный на древовидной дискретной графической модели, которая позволяет выбрать и промаркировать набор непересекающихся участков изображения полученные с помощью глобальной оптимизациимикроскопии, не имеют достаточно хорошее для дальнейшей работы качество. Каждый регион маркируется в соответствии Есть разные способы борьбы с количеством объектов, которые он содержитэтим. В условиях низкой плотности объектов методМожно улучшать качество двумерных изображений стандартными методами, как правилоне имеющих отличий, находит и выделяет отдельные клеткисвязанных со специфичностью данных, а в местахили же заранее пытаться получить высококачественное изображение, где клетки перекрываются, предложенный метод выделяет группы клеток. Подобное адаптивное поведение, управляемое оптимизационным процессом, является уникальным для данного методапредсказывая положение фокуса.

Нужно также отметить=== Предсказание положения фокуса ===При покадровой съемке длительного непрерывного процесса необходимо постоянно следить за положением фокуса микроскопа, чтобы не получать размытые изображения. Процесс выставления фокуса можно автоматизировать, построив сеть, которая будет предсказывать нужное положение. Эту задачу можно свести к задаче классификации изображений по фокусному расстоянию во время съемки. Для ее решения используется сверточная сеть (рисунок 9), что вывод модели эффективен с точки зрения вычислений которая состоит из двух блоков свертки и требует всего нескольких сотен оценок классификатора, за которыми следует динамическое программирование на поддеревьяхдвух полносвязных блоков для классификации<ref name="focus"/>.

== Склеивание = Восстановление рассеянных трехмерных изображений ===[[Файл:MIST3d restoration net.jpgjpeg|right|450px400px|thumb|Примеры изобпажений, склеенных с помощью MISTРисунок 10.]]Не всегда изучаемый объект полностью помещается на один снимок микроскопаСхема работы архитектуры ScatNet<ref name="scatnet">[https://www. В связи с этим стоит задача склеивания изображений для дальнейшего исследования целых клеточных культур, используя различные методы визуализацииosapublishing. Эту задачу может решить MIST (англorg/oe/fulltext. Microscopy Image Stitching Tool) cfm?uri=oe-28-20-30234&id=439993 Le Xiao {{---}} программа Deep learning-enabled efficient image restoration for 3D microscopy of turbid biological specimens, 2020]</ref>.]]Трехмерная флуоресцентная микроскопия является важным инструментом для быстрого и точного склеивания больших двумерных сеток перекрывающихся изображений покадровых снимков микроскопасовременных исследований, но ее более широкому применению препятствует рассеяние света биологическими образцами. В основе работы MIST подхода, который способен восстановить размытое и рассеянное светом трехмерное изображение глубоких тканей, лежит оценка параметров модели на основе вычисленных попарных перемещений, а затем минимизация ошибок склеивания путем оптимизации перемещений в пределах квадратной областисеть ScatNet<ref>[https://www.di.ens.fr/data/software/scatnet/ ScatNet: homepage of the project]</ref>.

Алгоритм MIST состоит В течение каждой эпохи обучения ScatNet учится, как лучше восстанавливать высококачественные изображения из четырех шаговразмытых входных данных. Сначала вычисляются всевозможные перемещения между соседними покадровыми изображениямиСгенерированный промежуточный результат для каждой эпохи сравнивается с данными фиксированной метки для оптимизации функции потерь сети<ref name="scatnet"/>. После чего, если параметры модели не указаны пользователем, оценивается модель механического предметного столика Более детальная схема работы представлена на основе вычисленных перемещенийрисунке 10. Затем оптимизируются перемещения между изображениями для уменьшения ошибок склеивания ScatNet способствует простому и быстрому восстановлению изображений и составляется полученное изображениене требует трудоемких ручных операций.

Необходимо помнить, что MIST был разработан для склеивания микроскопических изображений, полученных Такой подход позволяет с помощью механического предметного столика, который перемещает образец по повторяющейся сеткевычислений увеличить глубину визуализации изображений трехмерной флуоресцентной микроскопии без добавления сложной оптики или моделей оптического рассеяния, что накладывает ограничение так как основан только на его использованиемощных возможностях прогнозирования сверточной нейронной сети.

#* [[ Компьютерное зрение ]]#* [[ Глубокое обучение ]]* [[ Сверточные нейронные сети ]]#* [[ Batch-normalization ]]* [[ Сегментация изображений ]]