Изменения

[[Компьютерное зрение |Компьютерное зрение]] помогает автоматизировать обработку изображений, полученных с помощью микроскопии. С его появлением стало возможным эффективно и с хорошей точностью классифицировать клетки, сегментировать полученные изображения, улучшать их качество и решать другие задачи без участия человека<ref>[https://core.ac.uk/download/pdf/81981016.pdf Gaudenz Danuser {{---}} Computer Vision in Cell Biology, 2011]</ref>.

На данный момент компьютерное зрение нашло применение в большинстве направлений, где есть необходимость обрабатывать и анализировать изображения. Микроскопия не стала исключением. Теперь задачи, направленные непосредственно на работу с изображениями, можно решить используя методы [[Глубокое обучение|глубокого обучения]], например, построить подходящую [[Сверточные нейронные сети |сверточную нейронную сеть]]<ref>[https://www.researchgate.net/publication/221786123_Computer_Vision_for_Microscopy_Applications Nikita V Orlov {{---}} Computer Vision for Microscopy Applications, 2007]</ref>.

[[Файл:Dividing Cell Fluorescence-ru.jpg|left|300px|thumb|Рисунок 1. Пример клетки с различными флуоресцентными маркерами. <ref>[https://pubmed.ncbiru.nlmwikipedia.nih.govorg/wiki/30865716%D0%A4%D0%BB%D1%83%D0%BE%D1%80%D0%B5%D1%81%D1%86%D0%B5%D0%BD%D1%86%D0%B8%D1%8F_%D0%B2_%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D1%85_%D0%B8%D1%81%D1%81%D0%BB%D0%B5%D0%B4%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%8F%D1%85 Википедия: Флуоресценция в биологических исследованиях]</ статьиref>.]]]Классификация клеток является базовой задачей микроскопии. Обычно для этого используются изображения, полученные на флуоресцентных микроскопах(рисунок 1), так как классификаторы для изображений с обычных оптических микроскопов не способны отразить биологическое разнообразие различных типов клеток. Клетки можно делить по фазе в клеточном цикле, типу (повержденные или нет, раковые или нормальные), физиологическому состоянию, виду и другим признакам. Для большинства задач классификации уже существуют готовые архитектуры сверточных сетей<ref>[https://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:1334417/FULLTEXT01.pdf Håkan Öhrn {{---}} General image classifier for fluorescence microscopy using transfer learning , использующие флуоресцентные метки в качестве категориальных2019]</ref><ref name="phase">[https://www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information Philipp Eulenberg {{---}} Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2017]</ref><ref name="cancer">[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ Ronald Wihal Oei {{---}} Convolutional neural network for cell classification using microscope images of intracellular actin networks, 2019]</ref><ref name="blood">[https://www.nature.com/articles/s41598-020-59215-9 Ahmed T. Sahlol {{---}} Efficient Classification of White Blood Cell Leukemia with Improved Swarm Optimization of Deep Features, 2020]</ref><ref>[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/817544v1.full Samuel Berryman {{---}} Image-based Cell Phenotyping Using Deep Learning, 2019]</ref><ref>[http://www.mva-org.jp/Proceedings/2017USB/papers/06-01.pdf Nan Meng {{---}} Computational single-cell classification using deep learning on bright-field and phase images, 2017]</ref><ref>[https://arxiv.org/pdf/1806.01313.pdf Sachin Mehta {{---}} Y-Net: Joint Segmentation and Classification for Diagnosis of Breast Biopsy Images, 2018]</ref>.

Одним из признаков, по которым можно разделить клетки, является определение фазы клеточного цикла, в которой находится клетка. Эта задача имеет практическое применение для обнаружения поврежденных клеток, которые при визуализации будут кластеризоваться отдельно от остальных. Сверточная сеть для решения задачи изображена на рисунке 2. Она обучается на изображениях с флуоресцентными метками, о которых было сказано ранее, и дает на выходе не только классификацию каждой клетки, а также визуализирует процесс клеточного цикла, используя нелинейное уменьшение размерности<ref name="phase"/>. Классификация и визуализация являются всего лишь различными способами интерпретации результатов, поэтому строятся на основе одних и тех же выведенных закономерностей. [[Файл:Cell cycle classification.png|right|700px|thumb|Рисунок 2. Архитектура сверточной нейронной сети для определения фазы клетки из [https:<ref name="phase"//www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information/ статьи>.]]]Особенностью работы данной описанной сверточной сети является необходимость разметить только небольшую часть данных, на основании чего она далее учится размечать самостоятельно. Интересно, что при визуализации фазы становятся упорядочены в хронологически правильном порядке, несмотря на то, что информация о порядке фаз не передавалась в сеть напрямую. Это говорит об эффективности использования флуорисцентных флуоресцентных меток в качестве категориальных<ref>[https://www.nature.com/articles/s41467-017-00623-3#supplementary-information Philipp Eulenberg — Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2017]</ref>.

[[Файл:microscopy_cnn.png|right|400px|thumb|Рисунок 3. Архитектура сверточной нейронной сети для классификации раковых клеток из [https:/<ref name="cancer"/pubmed>.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ статьи.]]]Другой задачей классификации является обнаружение раковых клеток. Для ее решения используется сверточная нейронная сеть с архитектурой , изображенная на рисунке 3. Она имеет архитектуру VGG-16, в которой дополнительно после каждой функции активации добавлена [[Batch-normalization|пакетная нормализация]] для регуляризации<ref name="cancer"/>. Сеть, как и остальные классификаторы изображений микроскопии, принимает на вход изображения с флуоресцентными метками.

Особенностью при обучении сетки представленной сети является использование из-за недостаточного объема данных [[Глубокое обучение|трансферного обучения]], то есть модель предварительно обучается на другом огромном объеме данных. В данном случае первые 14 слоев сначала обучаются на наборе данных классификации ImageNet, а потом уже происходит обучение для классификации раковых и нормальных клеток. Такая сверточная сеть лучше справляется с задачей классификации клеток по сравнению с экспертом-человеком, особенно на изображениях с недостаточно хорошим качеством<ref>[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30865716/ Ronald Wihal Oei {{---}} Convolutional neural network for cell classification using microscope images of intracellular actin networks, 2019]</ref>.

[[Файл:Vggnet sessa.jpg|left|400px|thumb|Архитектура сверточной нейронной сети для Рисунок 4. Блок-схема подхода к классификации лейкоцитов<ref name="blood"/>.]]Эта задача отличается от предыдущих тем, что не требует предварительной обработки материалов и использования флуоресцентного микроскопа, для ее решения достаточно изображений с оптического микроскопа. Лейкоциты важно уметь классифицировать, потому что они играют значительную роль в организме человека и (иногда в крови могут образоваться злокачественные лейкоциты, которые способны вызывать лейкемию). Автоматическая классификация лейкоцитов может помочь специалистам в лабораториях слаборазвитых стран, где нет достаточного количества квалифицированных сотрудников для проведения анализа крови.

Для решения задачи используется сеть VGGNet, похожая на ту, что идентифицирует раковые клетки, и так же транзитное [[Глубокое обучение|трансферное обучение]]. Отличительной деталью является использования статистического для оптимизации статистически усиленного алгоритма оптимизации под названием сальпового роя (англ. Statistically Enhanced Salp Swarm Algorithm, SESSA )<ref name="blood"/> для выбора наиболее важных функций, извлеченных с помощью сети VGGNet, и удаления сильно коррелированных и шумныхфункций. Общая структура алгоритма представлена на рисунке 4. Такая оптимизация позволяет сократить время обучения, повысить точность и избавиться от переобучения. Результаты этого гибридного подхода к классификации являются самыми эффективными среди всех известных опубликованных работ по тому же набору данных.

Задача [[Сегментация изображений|сегментации изображений]], полученных с микроскопа, состоит в том, чтобы аннотировать их, то есть отмечать границы объектов (клеток, ядер). Имея сегментированное изображение, легче проводить дальнейший анализ и изучать конкретные части клетки<ref>[https://www.nature.com/articles/s41524-020-00363-x James P. Horwath {{---}} Understanding important features of deep learning models for segmentation of high-resolution transmission electron microscopy images, 2020]</ref>.[[Файл:DRAN.jpeg|250px|left|thumb|Рисунок 5. Архитектура сети DRAN для сегментации ядер<ref name="dran">[https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2019.00053/full Quoc Dang Vu {{---}} Methods for Segmentation and Classification of Digital Microscopy Tissue Images, 2019]</ref>.]] 

Для решения задачи сегментации обычно используется модифицированная полносвязная сверточная сеть U-Net<ref>[https://lmb.informatik.uni-freiburg.de/people/ronneber/u-net/ Olaf Ronneberger— Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2015]</ref>. Сеть U-Net получила широкое распространение благодаря способности последовательно распознавать как большие, так и мелкие частицы, а также устойчивости к различным условиям визуализации и наборам данных. Также она показывает хорошие результаты , даже если размер набора даных для обучения небольшой, что является частой проблемой анализа изображений, полученных с микроскопа. Однако минусом сети U-Net является ограничение на размер входного изображения, в то время как разрешение микроскопических изображений только растет с течением времени.

Сеть U-Net хоть и является универсальной, но для решения некоторых задач удобнее использовать более специализированные сети. Для задачи точной сегментации ядер клеток строится сеть глубокой остаточной агрегации (англ. Deep Residual Aggregation Network, DRAN)<ref name="dran"/>. Она имеет типичную для сегментирующих сетей архитектуру , представленную на рисунке 5, и состоит из нескольких слоев, понижающих степень дискретизации данных, затем нескольких расширяющих слоев с тремя декодерами.  Особенностью данных микроскопии является разный масштаб ядер на изображениях, поэтому в сеть подаются не только исходные изображения, а еще и уменьшенные и увеличенные в 2 раза. Такой подход частично решает проблему влияния существенно различающегося масштаба и получил название многомасштабной сети глубокой остаточной агрегации (англ. Multiscale Deep Residual Aggregation Network, MDRAN)<ref name="dran"/>. == Детекция клеток ==Во многих биологических экспериментах необходимо уметь детектировать клетки, за которыми ведется наблюдение, понимать сколько их, как они расположены относительно друг друга. Для решения этих задач в компьютерном зрении используется несколько разных подходов<ref>[https://ieeexplore.ieee.org/document/5711528 Takeo Kanade {{---}} Cell image analysis: Algorithms, system and applications, 2011]</ref>. Одни используют сверточные сети, чтобы предсказывать карту плотности, другие основаны на построении деревьев максимально устойчивых экстремальных областей. Вне зависимости от реализации, методы детекции клеток направлены на оценку количества клеток и учитывают перекрывания, неравномерность распредления клеток и другие факторы, специфичные для микроскопических изображений. === Подсчет клеток на основе сверточных сетей ===[[Файл:FCRN-A_and_FCRN_B.png|425px|thumb|right|Рисунок 6. Архитекутры полносверточных регрессионных сетей для построения карт плотности<ref name="fcrn">[https://www.robots.ox.ac.uk/~vgg/publications/2016/Xie16/xie16.pdf Weidi Xie {{---}} Microscopy cell counting and detection with fully convolutional regression networks, 2016]</ref>.]]К автоматическому подсчету клеток можно подойти с разных сторон. Первый подход основан на детекции с предварительной сегментацией изображения. Процесс сегментации сам по себе сложен и существует более эффективный способ. В его основе лежит регрессия и оценка плотности без непосредственной детекции и сегментации. По карте плотности можно с хорошей точностью оценить количество клеток.  Особенностью изображений микроскопии является то, что клетки в большинстве случаев имеют размер значительно меньший, чем размер изображения, то есть нет необходимости использовать сложные глубокие сети, которые способны выучить высоко семантическую информацию. Поэтому используются полносверточные регрессионные сети (англ. Fully Convolutional Regression Networks, FCRN)<ref name="fcrn"/>. Различия в архитектурах состоят в размерах ядер и количестве слоев (рисунок 6). Такие сети на выходе дают карту плотности клеток.

Особенностью данных микроскопии является разный масштаб ядер на изображенияхТакой подход позволяет проводить непрерывное обучение с изображениями произвольных размеров, поэтому что важно в сеть подаются не только исходные изображениятом числе для покадровой съемки и изучения длительных процесоов. Он также обеспечивает интуитивное понимание представлений функций из FCRN, визуализируя, а еще и уменьшенные и увеличенные в 2 раза. Такой подход частично решает проблему влияния существенно различающегося масштаба и получил название многомасштабной сети глубокой остаточной агрегации MDRANкакой степени информация была закодирована на разных уровнях.

== Улучшение качества изображений = Распознавание перекрывающихся объектов на основе деревьев экстремальных областей ===[[Файл:Autofocus cnnExtremal Region Trees.png|rightleft|450px250px|thumb|(a) Архитектура сверточной нейронной сети для предсказывания положения фокуса микроскопа из Рисунок 7. Получающаяся древовидная структура<ref name="tree">[httpshttp://wwwsites.natureskoltech.comru/app/data/uploads/articlessites/s4159825/2014/11/MIA15.pdf Carlos Arteta {{-018-25458-w}} Detecting Overlapping Instances in Microscopy Images Using Extremal Region Trees, 2016]</ статьиref>.]]Клетки на изображениях микроскопии могут быть распределены неравномерно, группироваться, перекрываться, что затрудняет подсчет количества клеток и их дальнейшее изучение, так как стандартные методы применимы либо к изображениям с высокой плотностью объектов и не пытаются их разделить, либо наоборот эффективно работают только с изображениями с низкой плотностью.

(b) Примеры изображений с разным фокусным расстоянием.]]Зачастую Чтобы учесть все особенности изображенияиспользуется метод, основанный на древовидной дискретной графической модели, полученные которая позволяет выбрать и промаркировать набор непересекающихся участков изображения с помощью микроскопииглобальной оптимизации<ref name="tree"/>. Каждый регион маркируется в соответствии с количеством объектов, не имеют достаточно хорошее для дальнейшей работы качествокоторые он содержит. Сверточные сетиВ условиях низкой плотности объектов метод, которые улучшают качество уже имеющихся снимковкак правило, находит и выделяет отдельные клетки, а в местах, где клетки перекрываются, предложенный метод выделяет группы клеток (рисунок 7). Подобное адаптивное поведение, не имеют отличийуправляемое оптимизационным процессом, связанных со специфичностью изображенийявляется уникальным для данного метода.

Гораздо более интересная задача компьютерного Нужно также отметить, что вывод модели эффективен с точки зрения состоит в томвычислений и требует всего нескольких сотен оценок классификатора, чтобы сразу получать более четкие изображения. При покадровой съемке длительного непрерывного процесса необходимо постоянно следить за положением фокуса микроскопа, чтобы не получать размытые изображения. Процесс выставления фокуса можно автоматизировать, построив сеть, которая будет предсказывать нужное положение. Эту задачу можно свести к задаче классификации изображений по фокусному расстоянию во время съемки. Для ее решения используется сверточная сеть, которая состоит из двух блоков свертки и двух полносвязных блоков для классификациикоторыми следует динамическое программирование на поддеревьях.

Такая сверточная сеть показывает большую точность== Склеивание изображений ==Не всегда изучаемый объект полностью помещается на один снимок микроскопа. В связи с этим стоит задача склеивания изображений для дальнейшего исследования целых клеточных культур, используя различные методы визуализации. Эту задачу может решить инструмент для сшивания изображений микроскопии (англ. Microscopy Image Stitching Tool, чем группа людейMIST)<ref>[https://ieeexplore.ieee.org/document/7359951 Joe Chalfoun {{--экспертов-}} MIST: Microscopy Image Stitching Tool, 2015]</ref>. По сравнению с другими подходами к автофокусировке, сеть не требует физической калибровки Программа предназначена для быстрого и устойчива к шумуточного склеивания больших двумерных сеток перекрывающихся изображений покадровых снимков микроскопа. В основе работы MIST лежит оценка параметров модели на основе вычисленных попарных перемещений, оптическим артефактам и особенностяма затем минимизация ошибок склеивания путем оптимизации перемещений в пределах квадратной области. [[Файл:MIST.jpg|left|450px|thumb|Рисунок 8. Примеры изображений, отличным от ячеексклеенных с помощью MIST<refname="mist">[https://www.nature.com/articles/s41598-018017-04567-y Joe Chalfoun {{-25458-w/ Ling Wei— Reconstructing cell cycle -}} MIST: Accurate and Scalable Microscopy Image Stitching Tool with Stage Modeling and disease progression using deep learningError Minimization, 20182017]</ref>.]]Алгоритм MIST состоит из четырех шагов<ref name="mist"/>. Сначала вычисляются всевозможные перемещения между соседними покадровыми изображениями. После чего, если параметры модели не указаны пользователем, оценивается модель механического предметного столика на основе вычисленных перемещений. Затем оптимизируются перемещения между изображениями для уменьшения ошибок склеивания и составляется полученное изображение (рисунок 8).

== Детекция клеток ==Во многих биологических экспериментах необходимо уметь детектировать клеткиНеобходимо помнить, за которыми ведется наблюдение, понимать сколько ихчто MIST был разработан для склеивания микроскопических изображений, как они расположены относительно друг друга. Для решения этих задач в компьютерном зрении используется несколько разных подходов. Одни используют сверточные сетиполученных с помощью механического предметного столика, чтобы предсказывать карту плотностикоторый перемещает образец по повторяющейся сетке, другие основаны что накладывает ограничение на построении деревьев максимально устойчивых экстремальных областей. Вне зависимости от реализации, методы детекции клеток направлены на оценку количетсва клеток и учитывают перекрывания, неравномерность распредления клеток и другие факторы, специфичные для микроскопических изображенийего использование.

=== Подсчет клеток на основе сверточных сетей =Улучшение качества изображений ==[[Файл:FCRN-A_and_FCRN_BAutofocus cnn.png|425pxleftright|400px|thumb|right|Архитекутры сетей FCRNРисунок 9. (a) Архитектура сверточной нейронной сети для предсказания положения фокуса микроскопа.(b) Примеры изображений с разным фокусным расстоянием<ref name="focus">[https://www.nature.com/articles/s41598-018-25458-w/ Ling Wei {{--A и FCRN-B для построения карт плотности}} Reconstructing cell cycle and disease progression using deep learning, 2018]</ref>.]]К автоматическому подсчету клеток можно подойти Зачастую изображения, полученные с разных сторонпомощью микроскопии, не имеют достаточно хорошее для дальнейшей работы качество. Первый подход основан на детекции Есть разные способы борьбы с предварительной сегментацией изображенияэтим. Процесс сегментации сам по себе сложен и существует более эффективный способ. В его основе лежит регрессия и оценка плотности без непосредственной детекции и сегментации. По карте плотности можно с хорошей точностью оценить количество клеток. РассмотримМожно улучшать качество двумерных изображений стандартными методами, не имеющих отличий, связанных со специфичностью данных, или же заранее пытаться получить высококачественное изображение, как она строитсяпредсказывая положение фокуса.

Особенностью изображений микроскопии является то=== Предсказание положения фокуса ===При покадровой съемке длительного непрерывного процесса необходимо постоянно следить за положением фокуса микроскопа, что клетки в большинстве случаев имеют размер значительно меньший, чем размер чтобы не получать размытые изображения. Процесс выставления фокуса можно автоматизировать, то есть нет необходимости использовать сложные глубокие сетипостроив сеть, которые способны выучить высоко семантическую информациюкоторая будет предсказывать нужное положение. Поэтому используются сети с архитектурой FCRN-A или FCRN-BЭту задачу можно свести к задаче классификации изображений по фокусному расстоянию во время съемки. Различия в архитектурах состоят в размерах ядер Для ее решения используется сверточная сеть (рисунок 9), которая состоит из двух блоков свертки и количестве слоев. Такие сети на выходе дают карту плотности клетокдвух полносвязных блоков для классификации<ref name="focus"/>.

Такой подход позволяет проводить непрерывное обучение Такая сверточная сеть показывает большую точность, чем группа людей-экспертов. По сравнению с изображениями произвольных размеровдругими подходами к автофокусировке, что важно в том числе для покадровой съемке сеть не требует физической калибровки и изучением длительных процесоов. Он также обеспечивает интуитивное понимание представлений функций из FCRNустойчива к шуму, визуализируя, в какой степени информация была закодирована на разных уровняхоптическим артефактам и другим особенностям.

=== Обнаружение перекрывающихся объектов на основе деревьев экстремальных областей Восстановление рассеянных трехмерных изображений ===[[Файл:Extremal Region Trees3d restoration net.pngjpeg|leftright|250px400px|thumb|Получающаяся древовидная структура из Рисунок 10. Схема работы архитектуры ScatNet<ref name="scatnet">[httphttps://siteswww.skoltechosapublishing.ruorg/appoe/data/uploadsfulltext.cfm?uri=oe-28-20-30234&id=439993 Le Xiao {{---}} Deep learning-enabled efficient image restoration for 3D microscopy of turbid biological specimens, 2020]</sites/25/2014/11/MIA15ref>.pdf статьи]]]Клетки на изображениях микроскопии могут быть распределены неравномерноТрехмерная флуоресцентная микроскопия является важным инструментом для современных исследований, группироватьсяно ее более широкому применению препятствует рассеяние света биологическими образцами. В основе подхода, перекрываться, что затрудняет подсчет количества клеток который способен восстановить размытое и их дальнейшее изучениерассеянное светом трехмерное изображение глубоких тканей, так как стандартные методы применимы либо к изображениям с высокой плотностью объектов и не пытаются их разделить, либо наоборот эффективно работают только с изображениями с низкой плотностьюлежит сеть ScatNet<ref>[https://www.di.ens.fr/data/software/scatnet/ ScatNet: homepage of the project]</ref>.

Чтобы учесть все особенности изображения используется методВ течение каждой эпохи обучения ScatNet учится, основанный на древовидной дискретной графической модели, которая позволяет выбрать и промаркировать набор непересекающихся участков как лучше восстанавливать высококачественные изображения из размытых входных данных. Сгенерированный промежуточный результат для каждой эпохи сравнивается с помощью глобальной данными фиксированной метки для оптимизациифункции потерь сети<ref name="scatnet"/>. Каждый регион маркируется в соответствии с количеством объектов, которые он содержитБолее детальная схема работы представлена на рисунке 10. В условиях низкой плотности объектов метод, как правило, находит ScatNet способствует простому и быстрому восстановлению изображений и выделяет отдельные клетки, а в местах, где клетки перекрываются, предложенный метод выделяет группы клеток. Подобное адаптивное поведение, управляемое оптимизационным процессом, является уникальным для данного методане требует трудоемких ручных операций.

Нужно также отметить, что вывод модели эффективен Такой подход позволяет с точки зрения помощью вычислений и требует всего нескольких сотен оценок классификатораувеличить глубину визуализации изображений трехмерной флуоресцентной микроскопии без добавления сложной оптики или моделей оптического рассеяния, за которыми следует динамическое программирование так как основан только на поддеревьяхмощных возможностях прогнозирования сверточной нейронной сети.

#* [[ Компьютерное зрение ]]#* [[ Глубокое обучение ]]* [[ Сверточные нейронные сети ]]#* [[ Batch-normalization ]]* [[ Сегментация изображений ]]